胶原蛋白不同制备工艺的优劣比较分析：基因重组法是未来发展趋势

——胶原蛋白是由动物的成纤细胞合成的一种生物高分子，是一种白色、不透明、无支链的纤维型蛋白质。胶原蛋白富含人体需要的甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸等氨基酸，其中甘氨酸含量占到将近1/3，而羟赖氨酸和羟脯氨酸是其他蛋白质缺乏的成分。

胶原蛋白最普遍的结构特征是三螺旋结构。胶原蛋白在结构上由三条a链多肽组成，每一条胶原链都是左手螺旋构型，三条相互独立的胶原蛋白肽链依靠甘氨酸之间形成的氢键维系三股螺旋相互缠绕的结构，使其分子结构非常稳定，并且具有低免疫原性和良好的生物相容性等。众多胶原蛋白大分子又可彼此并排形成纤维互相交联的结构，使最终产物具备较高机械强度。

胶原蛋白具备高拉伸强度、生物降解性能、低抗原活性、低刺激性、低细胞毒性以及作为人工器官骨架或创伤敷料时促进细胞生长、促进细胞粘附、与新生细胞和组织协同修复创伤等特性，这让胶原成为一种适用范围广泛的生物医用材料，目前已应用在敷料、人工器官再生医学、组织工程、生物护肤等领域。

胶原蛋白的构成

资料来源：公开资料

胶原蛋白广泛分布于人体的结缔组织中，如皮肤、软骨和骨、肌腱、韧带、角膜、器官被膜、硬脑膜等，是哺乳动物体内含量最丰富、分布最广的一种蛋白质，约占哺乳动物总蛋白的三分之一。一个成年人的身体内约有3公斤胶原蛋白，主要存在于人体皮肤、骨骼、眼睛、牙齿、肌腱、内脏（包括心、胃、肠、血管）等部位，其功能是维持皮肤和组织器官的形态和结构，也是修复各损伤组织的重要原料物质。在人体皮肤成分中，有70%是由胶原蛋白所组成。在显微镜下观察发现，胶原约占真皮结缔组织的95%；人体正常骨骼中含有80%的胶原；肌腱组织中胶原含量高达85%（以脱脂后的干重计）。

胶原蛋白在人体各部位的含量

资料来源：公开资料

根据胶原蛋白结构，可以分为纤维胶原、基膜胶原、微纤维胶原、锚定胶原、六边网状胶原、非纤维胶原、跨膜胶原等。根据它们在体内的分布和功能特点，可以将胶原分成间质胶原、基底膜胶原和细胞外周胶原。间质型胶原蛋白分子占整个机体胶原的绝大部分，包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原蛋白分子，Ⅰ型胶原蛋白主要分布于皮肤、肌腱等组织，也是水产品加工废弃物（皮、骨和鳞）含量最多的蛋白质，占全部胶原蛋白含量的80%～90%左右，在医学上的应用最为广泛；Ⅱ型胶原蛋白由软骨细胞产生，主要存在于软骨组织比如鼻子、肋骨、喉头、气管等部位；III型胶原蛋白主要在需要伸展的组织像子宫、肺、动脉和肾中广泛分布，具有极大的扩张力，约占人体胶原的5%-20%，在婴儿身体中的含量极高。基底膜胶原蛋白通常是指Ⅳ型胶原蛋白，其主要分布于基底膜。细胞外周胶原蛋白通常中指Ⅴ型胶原蛋白，在结缔组织中大量存在。

胶原蛋白分类、类型及分布

资料来源：《胶原蛋白与Ⅵ型胶原蛋白的结构概述》

——胶原蛋白可分为重组胶原蛋白和动物源胶原蛋白,目前市场上主流的胶原蛋白提取制备方法有两种：基因重组法和动物源提取法。根据不同的技术路径，所获得的胶原蛋白种类也不相同。重组胶原蛋白由基因工程重组合成，其原料是单细胞蛋白、酵母等，其水溶性较好，无病毒传染风险和排异反应。而动物源性胶原蛋白从动物组织中提取，其原料是牛腱，猪皮等动物组织，无水溶性且存在病毒传染风险和排异反应。

动物源胶原蛋白与重组胶原蛋白的对比

资料来源：公开资料

1、动物源提取法

动物源提取法是指通过酸法、碱法、酶法等方式从动物肌腱、皮肤等组织中来提取胶原蛋白。动物源提取法的过程可大致分为处理、溶出和纯化 3 个步骤。1）处理：动物组织的去脂、切片、清洗、消毒和粉碎等；2）溶出：添加蛋白酶、酸性介质进行反应；3）纯化：盐析、透析纯化等工艺。

创尔生物胶原原液的生产流程图

资料来源：创尔生物招股书

➢酶解法主要是利用蛋白酶限制性地切割胶原蛋白的末端肽，剩余的主体部分则可溶于中性或酸性溶液中，最终提取出酶溶性胶原蛋白。其中，胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶均是提取胶原蛋白的常用酶。酶解法是快速获得高品质胶原蛋白的有效途径，蛋白酶的加入可显著提高胶原蛋白的得率，酶溶性胶原蛋白不仅保留了酸溶性胶原蛋白完整的三螺旋结构及特有的生物活性，而且缩短了反应时间，获得的胶原纯度高、理化性质较好，用于高附加值产品的开发。

➢酸解法提取是指样品在经过前期除脂、除杂蛋白后，将其置于低离子强度的酸性介质中，胶原蛋白分子之间的盐键、Schiff碱受到破坏，从而将胶原蛋白溶解出来，通过盐析、透析等步骤最终得到酸溶性胶原蛋白。常用的溶剂为醋酸、乳酸、盐酸、柠檬酸。酸解法主要的优点在于处理温度低、三螺旋结构完整、成纤维性能佳、能保持较好的生物学特性，但胶原的端肽等区域得以保留，所得的胶原存在较高的免疫原性风险。另外，酸提取法在温度、时间、酸浓度以及料液比等不同的条件下，所制备的胶原产物略有不同，而且提取时间长、产率较低，但酸提取法成本较低，经济价值高，是目前较为常用的提取方法之一。

动物源提取技术中酸解法和酶解法的对比

资料来源：创尔生物招股书

根据胶原蛋白的来源，胶原市场又可细分为牛、猪、家禽、海洋等四种主要材料来源。（1）牛类仍是胶原最主要的材料来源，具有相容性好、材质柔软的特点，始终占据超过三分之一的市场份额，且其占比还在逐年缓慢提升。（2）猪胶原也是重要来源之一，优点是相容性好、稳定性高、不易发生形变、有利于细胞增值，缺点是存在口蹄疫疾病危机。（3）而海洋生物作为新兴研究热点，具有安全性高、易于提取的优点，近年来增长率较高，但由于溯源性等问题，海洋生物源胶原蛋白多用于食品、化妆品领域，极少作为医用胶原使用。现在所利用的胶原蛋白制品大都是从猪、牛等的皮中提取的，随着人类社会文明的日益发展，陆地的环境污染也愈加严重，陆生动物中先后出现疯牛病、禽流感、口蹄疫等严重的传染疾病，这样导致以陆生动物为原料的胶原蛋白产品产生了极大的安全隐患；而鱼类长期生活在较为洁净的水域中，目前还没有任何鱼类传染病直接传染给人类的记录，也不存在陆生动物胶原由宗教产生的使用限制问题。鱼类胶原蛋白主要来源于鱼皮和鱼鳞，与陆源性的胶原蛋白并无显著差异性。

2、基因重组法

基因重组法是将人体胶原蛋白基因进行特定序列设计、酶切和拼接、连接载体后转入工程细胞，通过发酵表达生产胶原蛋白。通过基因重组生物工程技术获得其结构与生物特性，这类胶原与人体内自身的胶原蛋白更加相似。目前已有多种通过基因工程生产重组胶原蛋白的方法，各方法全面涉及到大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、转基因作物等不同表达体系。

基因重组法制备重组胶原蛋白主要包括表达体系的构建、发酵以及纯化3个过程。1）表达体系构建：解构特定类型胶原蛋白的基因图谱，将基因进行特定序列设计、酶切和拼接、连接载体后转入宿主细胞；2）发酵：培养宿主细胞，使其发酵表达生产胶原蛋白；3）纯化：对菌液进行离心、过滤、离子交换、洗脱和冷冻干燥等。表达体系的构建按照宿主细胞的类别可分为微生物、动物、植物三大不同表达体系。动物细胞表达体系存在成本高昂、周期长等问题，而转基因作物提取、纯化胶原技术难度大、成本高、产率极低，因此目前可进入工业化生产或已商品化的重组胶原蛋白主要采用基于大肠杆菌、酵母等微生物发酵的技术，具体产物包括Ⅰ型或Ⅲ型的全长/非全长的重组人源胶原蛋白，以及来自微生物的胶原类似物。

重组胶原蛋白的获取和制备流程

资料来源：巨子生物公告

重组胶原蛋白主要分为33类，分别是：1）重组人胶原蛋白：由DNA重组技术制备的人胶原蛋白特定型别基因编码的全长氨基酸序列，且有三螺旋结构。目前，江苏吴中处于研发阶段。2）重组人源化胶原蛋白：由DNA重组技术制备的人胶原蛋白特定型别基因编码的全长或部分氨基酸序列片段，或是含人胶原蛋白功能片段的组合，代表公司有锦波生物、聚源生物、丸美股份、创健医疗和江苏吴中。3）重组类胶原蛋白：由DNA重组技术制备的经设计、修饰后的特定基因编码的氨基酸序列或其片段，或是这类功能性氨基酸序列片段的组合。其基因编码序列或氨基酸序列与人胶原蛋白的基因编码序列或氨基酸序列同源性低，代表公司有巨子生物。

三类重组胶原蛋白技术分类与代表公司

资料来源：NMPA

3、不同制备工艺的优劣比较

➢动物源提取法：生产胶原蛋白传统的制备方法是利用酸、碱水解法从动物结缔组织(猪皮、牛皮、鱼等)中提取胶原蛋白,动物源提取工艺相对成熟，已进行产业化制备，专业门槛和成本低。但目前市场上销售的胶原蛋白产品都是取自猪、牛、鱼等动物组织中，存在动物源病毒感染风险，又由于无法与人体相容，存在免疫排斥和过敏的风险。

➢基因重组法::与动物组织来源的天然胶原相比，采用微生物发酵的重组胶原蛋白具有较好的可加工性（如水溶性和乳化特性），能更好的控制致病病毒传播的风险，且可通过序列设计尽可能的降低免疫原性；但也存在有明显的缺陷，例如制备技术不成熟且成本高。

动物源提取法与基因重组法对比

资料来源：创尔生物招股书、各公司公告

4、基因重组法是未来发展趋势

天然提取法仍为当下主流，但基因重组法是未来发展趋势。2022年8月1日，中华人民共和国医药行业标准《重组胶原蛋白》正式发布并实施。这是国家首次针对重组胶原蛋白在医药领域出台的行业标准，该标准由国家药品监督管理局颁布实施。《重组胶原蛋白》行业标准的正式实施，将对重组胶原蛋白的质量控制、检测指标及其检测方法等给出明确要求，适用于作为医用原材料的重组胶原蛋白的质量控制，也将促进重组胶原蛋白市场更加规范健康有序地发展。目前，关于重组胶原蛋白应用的标准和法则还相对较少且发布时间晚，很难产生较广的影响，关于胶原蛋白在护 肤品应用上的标准和法则仍存在一定空白，使得该赛道的入局者缺乏相应的指导，未来随着法规的完善和影响日益增强，重组胶原蛋白将迎来广阔的发展前景。

近年来重组胶原蛋白相关政策

资料来源：NMPA

与动物源性胶原蛋白相比，重组胶原蛋白具有明显的优势，是一种相对更安全、更适合美丽与健康产品的材料。过去，动物源性胶原蛋白常常被应用于美丽与健康产品，主要由于其生产成本较低且生产过程更简单。然而，重组胶原蛋白具有包括生物活性及生物相容性更高、免疫原性更低、漏检病原体隐患风险更低、水溶性更佳、无细胞毒性以及可进一步加工优化等固有优势。鉴于重组胶原蛋白的变性温度在72°C以上，远高于动物源性胶原蛋白的变性温度40°C，因此重组胶原蛋白更容易运输和储存。具体而言，由于重组胶原蛋白相比动物源性胶原蛋白具备更高水平的生物兼容性、较低的漏检病原体隐患以及进一步加工和优化的能力，重组胶原蛋白有望成为面向大众市场的产品中更具优势的胶原蛋白。

重组胶原蛋白现阶段面临量产与技术问题。当前我国重组胶原蛋白技术仍处研发中，短期内仍面临技术与规模复制难度。重组技术的核心是胶原蛋白的翻译后修饰，具有热稳定性的重组胶原蛋白需要高水平的表达体系与足够的 P4H 进行活性催化。但当前技术路径难以实现充分羟基化，并导致生理温度下胶原蛋白的基本螺旋构象遇热不稳定，影响其在针剂注射领域中的填充与支撑作用。随着未来技术的不断发展，重组胶原蛋白有望打破规模的限制。

采用重组胶原蛋白的企业主要有巨子生物、锦波生物、创健医疗。巨子生物主要产品有可丽金（保湿/修护等护肤品）、可复平（口腔粘膜修复液等口腔健康产品）、可痕（修复术后疤痕），锦波生物主要产品有医美产品、护肤产品、消毒产品等，创健医疗主要产品有美容化妆品（面膜、精华、膏霜等）、营养保健品（胶原蛋白粉、口服液）、医疗器械。采用动物源胶原蛋白的企业主要有创尔生物、台湾双美。创尔生物主要产品有创福康（械字号产品，如胶原贴辅料、胶原蛋白海绵等）、创尔美（妆字号产品，如面膜、原液等），双美生物主要产品有胶原蛋白注射剂、护肤品。

主流胶原蛋白品牌采用的工艺及产品

资料来源：各公司官网